22/06/01

Documento del IRTA

Marcadores de ADN tipo microsatélite para la identificación de variedades de melocotonero y nectarina

Introducción

La identificación varietal con datos sobre la morfología y fisiología de los frutales se realiza en ensayos de campo que requieren largo tiempo, generalmente años, de observación. Estos procesos son demasiado lentos para aplicaciones como el control de calidad (identidad) en vivero o para la protección de los derechos de obtentor. Los marcadores moleculares, basados en la variabilidad del ADN, pueden detectarse en cualquier momento del desarrollo de la planta, y en diferentes tejidos, permitiendo establecer en pocos días un perfil único para cada variedad.

La investigación sobre marcadores de ADN en el IRTA                                

El Departamento de Genética Vegetal del IRTA ha investigado en los últimos 19 años en marcadores moleculares de todo tipo aplicados a la genética y mejora de plantas. Una parte importante de esta investigación se ha dedicado a los árboles frutales del género Prunus,  especialmente al melocotonero y almendro. El grupo ha coordinado el primer proyecto europeo de desarrollo del mapa genético de marcadores en Prunus, y es uno de los equipos de referencia en este ámbito a nivel internacional. Recientemente ha ensayado diversas metodologías de análisis de identificación varietal con marcadores moleculares, utilizando tejidos de hoja y fruto, y evaluado su eficiencia. Este trabajo ha revelado que los marcadores de tipo microsatélite superan claramente al resto, lo que ha llevado al desarrollo de un juego de microsatélites propio. Actualmente se dispone de un banco de datos de identificación con microsatélites para más de 200 variedades de melocotonero y nectarina incluidas las analizadas en este informe.

IRTAGen es el servicio de análisis genéticos del IRTA que, entre otras aplicaciones de las tecnologías de ADN, pone a disposición del sector los marcadores moleculares para identificación varietal. En caso de litigio y si su presencia es requerida, IRTAGen intervendrá como experto en la materia.

¿Qué son los microsatélites?                                                                          

Los microsatélites son secuencias cortas de ADN constituidas por motivos de 1 a 6 nucleótidos ("letras") que se repiten consecutivamente 10 o más veces. Estas secuencias simples de ADN son muy variables y pueden ser estudiadas con una metodología rápida y relativamente simple (ver Figura 1). Los microsatélites también son conocidos como SSRs ("Simple Sequence Repeats").  

Figura 1. Diagrama del método obtención de marcadores de tipo microsatélite.

 ¿Por qué son buenos marcadores de ADN?                                     

 Los microsatélites reúnen una serie de características que los hacen idóneos para ser utilizados para la identificación varietal y en programas de mejora, de manera muy especial en cultivos con un nivel bajo de variación genética, como es el caso del melocotonero y la nectarina, porque:

·         Son altamente polimórficos

·         Son muy abundantes y están distribuidos por todo el genoma

·         Son de herencia codominante (se distinguen todos los homocigotos entre sí y estos de los heterocigotos)

·         Son muy reproducibles

·         Se necesita poco ADN para detectarlos

·         Su automatización es fácil

 Una vez superados algunos problemas de su método de desarrollo, los microsatélites se están imponiendo como marcadores de alta calidad. Solamente dentro del último año se han publicado alrededor de 150 artículos en revistas científicas prestigiosas sobre aplicaciones de estos marcadores en plantas, cuatro de ellos en melocotonero. Contando los que nosotros hemos obtenido, existen actualmente 65 microsatélites útiles para esta especie. Se trata, por tanto, de una técnica contrastada, en desarrollo constante, y actualmente en auge. 

¿Para qué sirven?                                                                                         

Entre las aplicaciones de los microsatélites destacan las siguientes:

·         Identificación varietal para control de calidad o protección de derechos de obtentor

·         Control de pureza en híbridos F1

·         Análisis de pedigríes y tests de paternidad

·         Construcción de mapas genéticos y selección de todo el genoma

·         Selección de genes con marcadores estrechamente ligados a ellos

 

¿ Cómo se realiza un test de identificación varietal?                                      

En primer lugar se extrae el ADN de una muestra de la variedad a estudiar. El ADN puede obtenerse de tejido de hoja o de fruto y cada extracción permite estudiar muchos microsatélites. Cada uno de ellos da un patrón de bandas (o picos si se usa un secuenciador automático), normalmente una o dos por microsatélite. La suma de la información producida por varios microsatélites distintos (entre 15 y 25 es un número  suficiente) producen un patrón de bandas conjunto que es específico de esta variedad. Este patrón de bandas es como una huella dactilar, perfil molecular o genotipo de la variedad y puede ser usado para distinguirla de las demás.

Si tenemos el perfil molecular de una muestra desconocida y queremos saber si corresponde al de una variedad determinada, tendremos que compararlos. Si los dos perfiles difieren entre sí, las variedades son distintas. Si los dos perfiles son iguales las variedades son idénticas o, caso poco probable, tienen el mismo patrón de bandas siendo distintas. Para resolver este último dilema, se puede calcular la probabilidad de encontrar un perfil idéntico al de la variedad conocida con los microsatélites que hemos usado para caracterizarla (coeficiente “I”). En un estudio realizado en nuestro laboratorio con 24 variedades y 38 microsatélites (Aranzana y col. 2001), el valor medio de este coeficiente fue de 5x10-16, lo que significa que la probabilidad media de que se pueda encontrar por azar un patrón de bandas idéntico al obtenido siendo la variedad distinta es de cinco en 10.000 billones, es decir una probabilidad tan baja como para descartar esta hipótesis con gran seguridad.

 Los microsatélites son altamente eficientes para la identificación varietal      

 En este mismo estudio, se necesitaron solamente 3 microsatélites para diferenciar las 24 variedades. Los 35 marcadores restantes fueron utilizados para obtener valores de "I" muy bajos. El cálculo de "I" se ha realizado como producto de las probabilidades de encontrar el genotipo observado para cada microsatélite. Esta probabilidad se ha calculado con datos de más de 100 variedades de nuestra base de datos.

Otra investigación de nuestro equipo permitió, después del análisis con marcadores de 18 plantas de melocotonero procedentes de semilla, agruparlas por su procedencia de tres cruzamientos distintos. Posteriormente, se determinó también cuales eran los parentales de cada uno de estos cruzamientos con la ayuda determinante de solo 4 microsatélites. Este análisis se realizó considerando 37 parentales posibles, o sea, que había que elegir entre un total de 703 combinaciones de pares de ellos. El hecho que los microsatélites sean de herencia codominante fue esencial para poder establecer estas relaciones de parentesco, de una manera sin duda mucho más precisa que con otros marcadores dominantes como los AFLPs o RAPDs.

Los datos se obtienen con ADN que puede extraerse en cualquier punto de la cadena de distribución, con una muestra de 4-5 frutos. Se puede disponer de los resultados en un tiempo corto (una semana) y revisarlos cuando sea necesario ya que el ADN se conserva durante años.

La Oficina Comunitaria de Variedades Vegetales permite depositar el perfil de microsatélites de una nueva variedad como información complementaria a su caracterización por medios convencionales.  Una comisión ha sido creada para estudiar su incorporación como método alternativo a la identificación varietal. 

 Bibliografía                                                                               

Aranzana, M.J., J. Ballester, J. Carbó y P. Arús. Microsatélites: marcadores de alta eficiencia para la identificación varietal de melocotonero. Fruticultura Profesional, nº 118; Abril 2001. 

 

                                                                           Cabrils, Abril de 2001

 

 

 

 

 


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